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2024年7月山东大学丁兆军教授团队在Advanced Science（IF=14.3）杂志上发表题为“VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”文章。研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现VIK介导的生长素信号转导分别通过增强LBD18的蛋白质稳定性和诱导ERF13的降解来调节侧根发育。拜谱生物为该研究提供了磷过酸淡化组学、LC-MS/MS磷过酸位点进行分析技术服务。
英文音标题头：VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis（Advanced Science，IF=14.3，2024.07）
中文版名称：VIK介导的生长素信号调节拟南芥侧根发育
业主工作单位：山东大学
深入分析文件：拟南芥侧根
拜谱带来了技艺：磷碱化淡化组学、LC-MS/MS磷碱化位点研究分析
调查思维：
PART 01 研发报告单
01、衍生素可以淡化VIK的磷硝化作用和其转录
为了鉴定生长素触发的潜在磷酸化调控因子，作者对10日龄拟南芥幼苗根用10 µM 萘乙酸（NAA）处理15分钟和8小时后进行磷硝化作用球膳食纤维类物质析，结果发现VIK可能通过磷酸化修饰在介导生长素信号传递中发挥关键作用（图1A）。
图1 植物的生长素利于VIK的磷酸性反应试述转录
为了验证上述结果，作者在大肠杆菌中表达了带有6个组氨酸标签的重组VIK蛋白（His-VIK），并在细胞自由蛋白系统中进行了磷酸性反应进行实验。发现His-VIK随着时间的推移磷酸化水平略有增加。在野生型拟南芥幼苗的根组织裂解液中，NAA处理15分钟和30分钟后，His-VIK的磷酸化水平显著增加，表明生长素能显著促进VIK的磷酸化（图1B）。
通过酵母菌双混种杂交解析（Y2H）和烟草叶片中的荧光素酶专一性影像实验所（LCI）证实了VIK与TMK1之间存在直接相互作用，并且身体外磷碱化实验表明TMK1可以磷酸化VIK。通过生成ProVIK:VIK-GFP转基因系进行的蛋白降解实验显示生长素可能不影响VIK蛋白的稳定性（图1C）。实时路况酶联免疫法PCR分析发现，生长素处理能时间依赖性地诱导VIK转录水平的增加（图1D），且这种诱导主要通过ARF7/19依赖性方式实现，在arf7/19突变体中VIK表达的诱导明显减弱，而在lbd16/18/33突变体中VIK表达仍能被生长素显著诱导。
02、VIK 介导的叶绿素无线信号积极向上控制 LR 成长
经过分折两个人VIK T-DNA放变异体（vik-2和vik-3），察觉到与纯天然型比较，变异体的LR相对体积密度、LR原基（LRP）和已骨骼发肓的LR为显著削减，十分是vik-2（图2）。颠倒，过体现出VIK的转人类什么是基因根系的表现出LR相对体积密度增添。不但，在vik-2变异体蓝本下体现出VIK的转人类什么是基因根系还原了LR骨骼发肓瑕疵。繁殖胸部阴茎发育素处里实验室表述，vik-2变异体对繁殖胸部阴茎发育素诱骗的LR骨骼发肓反應减低，表述VIK在繁殖胸部阴茎发育素调节用途LR骨骼发肓中充分利用根本用途。 
图2 VIK介导的成长素无线信号环路正向着监测LR的发育期
03、VIK 与ERF13 进行物理学交互式
研究发现VIK在生长素诱导的侧根（LR）发育中扮演关键角色，因此推测ERF13可能是VIK的潜在底物。通过Y2H、LCI、双氧分子荧光互替 （BiFC）和天然免疫共乳浊液实践（CO-IP），证实了VIK与ERF13之间存在直接的相互作用（图3）。这些结果表明VIK与ERF13在物理上相互作用，支持了ERF13可能是VIK作用底物的假设。
图3 VIK与ERF13能够 功能
04、VIK以双面馈的办法干预ERF13磷碱化
通过磷过酸蛋清组学浅析，发现NAA处理可快速诱导ERF13磷酸化。体外实验表明，VIK具有自磷酸化活性，并可直接磷酸化ERF13的Ser168和Ser172位点（图4）。点变化显示显著降低了ERF13的磷酸化水平。此外，ERF13可增强VIK的自磷酸化，尤其是ERF13的磷酸模拟突变体。进一步实验表明，VIK可通过形成同源二聚体进行自磷酸化，但ERF13突变体不影响VIK二聚体的形成。总体而言，VIK通过反馈机制调控ERF13的磷酸化。
图4 VIK以双面馈方式方法磷酸性反应ERF13的Ser168和Ser172位点
05、VIK介导的磷酸性反应促使ERF13降解塑料
研究发现，VIK介导的磷酸化作用影响ERF13蛋白的稳定性，进而调控侧根发育。实验显示，ERF13蛋白在早期侧根原基中表达，随后在发育过程中消失，而VIK蛋白在所有侧根中持续表达（图5）。通过身体外测试和体中测试，发现VIK能够促进ERF13的降解。进一步通过磷酸模似和磷酸降解突变的体的实验，证实了ERF13在Ser168和Ser172位点的磷酸化促进了其降解。此外，VIK与MPK14可能协同作用促进ERF13降解，但两者之间没有直接的相互作用。最后亚人体细胞市场定位定性分析表明，ERF132D和ERF132A均位于细胞核，且与WT无明显差异。qRT-PCR结果显示，vik-2突变体中ERF13 mRNA水平未显著变化，但其下游基因KCS8和KCS16显著降低，进一步证明VIK在蛋白水平上调控ERF13。总之，VIK介导的磷酸化通过负调控ERF13的稳定性，加速生长素诱导的ERF13降解。
图5 VIK 介导的磷碱化加速器了ERF13吸附
06、VIK 介导的 ERF13 磷碱化上下调整 LR 的出現
研究分析进十步浅谈了VIK宏观调控的ERF13吸附在侧根（LR）发育期中的能力。根据十分有差异 转什么是基因作物系的LR表型，会知道过呈现ERF13仰制了LR的会存在，在vik基因突变体中那样仰制能力不断增强，而在过呈现YFP-VIK的背景图片下那样仰制能力减低（图6）。不但，十分ERF13的有差异 磷过酸仿真模拟训练和磷酸灭活突变体的过呈现作物系，会知道ERF132A-Myc（磷酸灭活）的作物系LR会存在更罕见，而ERF132D-Myc（磷过酸仿真模拟训练）的作物系LR会存在略多。这类结论发现，VIK介导的ERF13磷过酸和吸附加速了LR的会存在。 
图6 VIK介导的ERF13磷过酸提高LR的有
07、VIK在侧根大中磷酸性反应并稳定的LBD18血清
顺利通过进行分析两位VIK T-DNA放进去转变体（vik-2和vik-3），感觉与天然的型相信，转变体的侧根（LR）强度、LR原基（LRP）和已阴茎胸部阴茎健康的LR相关系数抑制，特别是在是vik-2（图7）。反，过意味着出来VIK的转DNA植物体展现出LR强度增大。凡此种种，在vik-2转变体游戏 背景下意味着出来VIK的转DNA植物体可以恢复了LR阴茎胸部阴茎健康缺欠。繁殖素整理工作意味着，vik-2转变体对繁殖素诱导性的LR阴茎胸部阴茎健康的作用削弱，意味着VIK在繁殖素房产调控LR阴茎胸部阴茎健康中产生重要的作用。 
图7 VIK 在LR出现时候中之间磷过酸和稳定的LBD18血清
PART 02 论文总结ppt
生长素作为最重要的植物激素之一，在调控植物生长和发育过程中起着关键作用。这项研究通过磷硝化作用淀粉酶质组学研究筛选到快速响应生长素的蛋白激酶VIK，并证实VIK通过调控LBD18和ERF13来调控侧根的形成。一方面，生长素以ARF7/19依赖的方式诱导VIK的转录；另一方面，它通过TMK1激活VIK的激酶活性，激活的VIK可以磷酸化LBD18和ERF13。磷酸化的LBD18变得更加稳定，调节侧根的启动。然而，磷酸化的ERF13经历降解，缓解了其对侧根出现的抑制，从而促进侧根的形成（图8）。VIK的发现不仅丰富了我们对生长素信号传递机制的理解，而且为农业生产中通过调控生长素信号来提高作物产量和抗逆性提供了潜在的策略。
图8 VIK介导的发育素移动信号调节器侧根导致
PART 03 拜谱总结ppt
研究采用磷酸化修饰组学、LC-MS/MS质谱分析、CO-IP、酵母双杂和荧光素酶互补成像等技术，发现 VIK 介导的生长素信号转导分别通过增强 LBD18 的蛋白质稳定性和诱导 ERF13 的降解来调节 LR 发育。拜谱生物作为一家国内领先的多组学服务公司，可提供完善成熟的蛋白酶酶质组学、修饰语蛋白酶酶质组学、代谢转化组学、转录组学等多组学产品技术服务体系。拜谱特色磷酸化修饰产品—混凝土泵送深浅DIA·磷硝化作用修饰语组，采用创新聚集工艺+Astral DIA，超高深度赋能低丰度磷酸化蛋白/位点发掘，单针最高可实现昆虫范本10w+、树木范本5w+磷酸化修饰位点检出，可广泛应用于植物、动物研究，绘制物种磷酸化修饰图谱，助力高分文章发表。此外，磷酸化修饰组学可与蛋白组学、代谢组学等多组学联合，整合多组学数据进行深入挖掘分析，全面解析机制机理等。欢迎咨询！
借鉴文章：
Shang E, Wei K, Lv B, Zhang X, Lin X, Ding Z, Leng J, Tian H, Ding Z. VIK-Mediated Auxin Signaling Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 3:e2402442. doi: 10.1002/advs.202402442. Epub ahead of print. PMID: 38958531.
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